Пространственная организация комплексов ДНК-Dps

При наступлении неблагоприятных условий, например, таких как окислительный стресс, высокая концентрация токсичных катионов, воздействие ультрафиолетового излучения или высоких температур, многие бактерии способны «прятать» свой геном за счет сокристаллизации ДНК с белком Dps [1–3]. Название этого белка является англоязычной аббревиатурой от словосочетания «ДНК-связывающие белки голодающих клеток», так как этот белок впервые был обнаружен в большом количестве в комплексе с ДНК у бактерий, которые недополучали питательные вещества. Позднее выяснилось, что данный белок является родственным ферритину, белку, ответственному за метаболизм железа у людей и животных. Молекула Dps Escherichia coli состоит из 12 идентичных субъединиц, состоящих из 167 аминокислотных остатков молекулярной массой 18,7 кДа [3].

Сокристаллы ДНК-Dps были охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии, флуоресцентной микроскопии, рентгеновской кристаллографии и малоуглового рентгеновского рассеяния [4–8]. Эти исследования выявили неспецифический характер связывания ДНК с Dps, который опосредован электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и положительно заряженными лизинами на N-конце субъединиц Dps.

Существует несколько предполагаемых моделей пространственной организации ДНК в сокристаллах ДНК-Dps. В одной из них предполагается, что молекулы ДНК пронизывают гексагональную решетку Dps, пересекая поочередно разные упакованные листы Dps. Другая модель предполагает накручивание нити ДНК вокруг молекул Dps подобно взаимодействию ДНК с гистонными белками. Некоторые исследователи считают, что ДНК выстраивается вдоль рядов молекул Dps, образующих один двумерный упорядоченный лист. Наконец, существуют также модели, допускающие комбинацию некоторых вышеупомянутых структур.

Разнообразие интерпретаций структурных особенностей сокристаллов ДНК-Dps создает необходимость их дальнейшего подтверждения или уточнения. Уникальную информацию о структурных особенностях взаимодействия ДНК с Dps может предоставить атомно-силовая микроскопия (АСМ). АСМ успешно зарекомендовала себя при изучении структурных особенностей нуклеиновых кислот, белков и их комплексов на уровне отдельных молекул и с высоким, субнанометровым пространственным разрешением. В частности, АСМ уже успешно применялась для исследования морфологии и размеров богатого Dps нуклеоида лизированных бактериальных клеток, а также изучения способности белков Dps связываться с ДНК и конденсировать её при различных значениях pH. Проведение многостороннего АСМ-анализа отдельных комплексов ДНК-Dps и сокристаллов ДНК-Dps способно значительно продвинуть наше понимание об устройстве нуклеоида бактерий и механизмах защиты бактериального генома от неблагоприятных воздействий окружающей среды.

Ведущий научный сотрудник кафедры физики полимеров и кристаллов Е.В. Дубровин совместно с коллегами из Института физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина РАН, Института кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН, ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА и Университета Тюбингена сформировали и визуализировали с высоким пространственным разрешением отдельные комплексы ДНК-Dps, а также охарактеризовали их морфологию и структурные особенности [9]. Комплексы ДНК-Dps формировали на основе линеаризованной плазмидной ДНК известной длины (4500 пар нуклеотидов), а затем наносили на поверхность высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ), модифицированную N,N’-(декан-1,10-диил)бис(тетраглицинамидом) (GM). Такая поверхность является положительно заряженной и поэтому способна «захватывать» отрицательно заряженные молекулы ДНК за счет электростатического притяжения.

На АСМ-изображениях комплексы ДНК-Dps выглядят в виде отдельных нитей ДНК с «нанизанными» на них глобулами, молекулами Dps (рисунок 1). Количество таких глобул при используемом весовом соотношении ДНК к белку (1:5) варьировало от 1 до 7. Средняя контурная длина таких комплексов лежала в диапазоне от 1500 до 1550 нм и не выявила зависимости от количества связавшихся молекул белка (рисунок 2а). Данный результат свидетельствует о том, что при образовании комплекса ДНК не накручивается вокруг молекул Dps, что отличает эту систему от комплексов ДНК с гистонными белками. В то же время полученные данные не исключают того, что ДНК может огибать небольшую область поверхности молекулы Dps.

Рис. 1. (а) Подборка АСМ-изображений (слева вверху) линеаризованной молекулы ДНК и (остальные изображения) отдельных комплексов линеаризованной ДНК-Dps, адсорбированных на поверхность GM-ВОПГ. АСМ-изображения были получены на воздухе. Размеры АСМ-изображений составляют 400?400 нм2, 400?800 нм2 и 800?400 нм2. (б) Распределение по высотам молекул Dps в комплексах. Перепечатано из [9], Копирайт (2021), с разрешения Эльзевир

Для оценки степени возможного изгиба молекулы ДНК при её связывании с молекулой белка Dps был проведен анализ угла ? между двумя касательными к контуру ДНК в точках входа в белковую глобулу (рисунок 2б). Гистограмма распределения угла ? для комплексов ДНК-Dps, а также его гауссова аппроксимация показаны на рисунке 2б голубым цветом. Максимум при 0° свидетельствует о том, что молекула Dps не способствует изгибу ДНК при связывании с ней. При этом длина невизуализируемого фрагмента ДНК между двумя точками ее входа в белковую глобулу может быть оценена как кажущийся (то есть уширенный зондом атомно-силового микроскопа) на АСМ-изображениях диаметр молекулы Dps в составе комплекса, который составляет 22±1 нм. Гистограмма распределения угла ? для свободных, то есть не образующих комплекс с Dps молекул ДНК, для контурной длины 22 нм, а также соответствующая гауссова аппроксимация представлены для сравнения на рисунке 2б красным цветом. Наблюдаемая разница в распределении углов может быть связана с «заморозкой» флуктуации контура молекул ДНК на некоторой длине lfix. Длину такого «замороженного» сегмента можно считать длиной участка ДНК, непосредственно взаимодействующего с одной молекулой Dps. Для того чтобы оценить lfix, зависимость cos(?) от контурной длины для свободной ДНК сравнивалась со значением cos(?) для комплексов ДНК-Dps (0,662±0.022 рад) (рисунок 2в). Согласно проведенному анализу длина флуктуирующего фрагмента ДНК внутри уширенного АСМ-изображения молекулы Dps составила 16±2 нм, что дает значение 6,0±2,2 нм для lfix. Это позволяет заключить, что при связывании с ДНК одна молекула Dps непосредственно контактирует с участком ДНК длиной около 6 нм.

Рис. 2. (a) Зависимость средней длины комплекса ДНК-Dps от количества связавшихся молекул. (б) (слева) Блочная диаграмма распределений видимого угла изгиба ДНК ? в комплексах ДНК-Dps и у свободной ДНК для контурной длины l=22 нм, отраженная относительно нулевого значения; (справа снизу) соответствующие распределения (сплошными линиями показаны гауссовы аппроксимации для обоих распределений); (справа сверху) схема, иллюстрирующая определение угла изгиба ?. (в) Зависимость cos(?) от контурной длины сегмента свободной молекулы ДНК (тонкая красная кривая) и значение cos(?) для комплексов ДНК-Dps (серая кривая, толщина учитывает стандартное отклонение среднего). (г) Распределение нормализованной контурной длины Dend/L между молекулой Dps в комплексе ДНК-Dps и его ближайшим концом. Перепечатано из [9], Копирайт (2021), с разрешения Эльзевир

Анализ расстояний от связанных с ДНК молекул Dps до ближайшего конца подтвердил отсутствие специфичности связывания Dps с ДНК (рисунок 2г). Наличие небольших упорядоченных агрегатов Dps, ассоциированных с молекулами ДНК (рисунок 3а), позволило определить возможную упаковку ДНК в таких агрегатах. Оказалось, что суммарная длина видимой части молекулы ДНК (то есть выходящей за пределы белкового агрегата) значительно меньше средней контурной длины молекулы ДНК. Разница между длиной ДНК и видимой частью ДНК в таких комплексах, вероятно, сосредоточена внутри агрегатов Dps. Эта «недостающая» длина всегда была значительно больше латеральных размеров агрегатов Dps, которые, как правило, лежали в диапазоне 50-70 нм. Поэтому ДНК внутри таких агрегатов проходит не напрямую от одной точки входа к другой. Поскольку, как показано выше, накручивание ДНК вокруг молекул Dps не происходит, рационально предположить, что внутри агрегатов Dps ДНК изменяет свое направление несколько раз, то есть проходит «змейкой».

Объём квазикристаллов ДНК-Dps увеличивается с увеличением «недостающей» длины ДНК (L-Lvis., где L — средняя контурная длина молекулы ДНК, а Lvis. — длина видимой ее части на АСМ-изображении в составе комплекса с агрегатом Dps) (рисунок 3б). Из линейной аппроксимации этой зависимости следует, что коэффициент пропорциональности между объёмом и длиной составляет 56±9 нм2. Учитывая объем одной молекулы Dps, можно оценить длину ДНК, приходящуюся на одну молекулу Dps в квазикристалле, в 7,5±1,4 нм. Это значение соответствует в пределах погрешности расстоянию между гексагонально уложенными рядами молекул Dps, которое составляет ~7,8 нм. Полученные результаты соответствуют модели расположения ДНК, в которой предполагается, что молекула ДНК проходит вдоль рядов упорядоченных молекул Dps в гексагонально упакованном слое.

Рис. 3. Пространственная организация ДНК в кристаллах ДНК-Dps. (a) (левая колонка) Подборка АСМ-изображений, демонстрирующих отдельные комплексы плазмидной ДНК с небольшими скоплениями Dps (квазикристаллами). Увеличенные области со скоплениями Dps показаны по каналам «высота»(средняя колонка) и «фаза» (правая колонка). АСМ-изображения получены на воздухе. Размер АСМ-изображений составляет 250?400 нм2 (увеличенные области 100?100 нм2). (б) Зависимость объёма квазикристаллов Dps-ДНК от «недостающей» контурной длины фрагмента ДНК (L – Lvis.). Линия демонстрирует линейную аппроксимацию. Перепечатано из [9], Копирайт (2021), с разрешения Эльзевир

Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на взаимодействие ДНК с Dps, в частности на организацию их комплексов и сокристаллов, а также на механизмы выживания бактерий в неблагоприятных условиях.

Список использованной литературы

[1] A. Martinez, R. Kolter, Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps., Journal of Bacteriology. 179 (1997) 5188–5194. https://doi.org/10.1128/jb.179.16.5188-5194.1997.

[2] S. Nair, S.E. Finkel, Dps Protects Cells against Multiple Stresses during Stationary Phase, Journal of Bacteriology. 186 (2004) 4192–4198. https://doi.org/10.1128/JB.186.13.4192-4198.2004.

[3] M. Almir?n, A.J. Link, D. Furlong, R. Kolter, A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli., Genes Dev. 6 (1992) 2646–2654. https://doi.org/10.1101/gad.6.12b.2646.

[4] A. Moiseenko, N. Loiko, K. Tereshkina, Y. Danilova, V. Kovalenko, O. Chertkov, A.V. Feofanov, Y.F. Krupyanskii, O.S. Sokolova, Projection structures reveal the position of the DNA within DNA-Dps Co-crystals, Biochemical and Biophysical Research Communications. 517 (2019) 463–469. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.07.103.

[5] Y.T. Sato, S. Watanabe, T. Kenmotsu, M. Ichikawa, Y. Yoshikawa, J. Teramoto, T. Imanaka, A. Ishihama, K. Yoshikawa, Structural Change of DNA Induced by Nucleoid Proteins: Growth Phase-Specific Fis and Stationary Phase-Specific Dps, Biophysical Journal. 105 (2013) 1037–1044. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2013.07.025.

[6] P. Ceci, L. Mangiarotti, C. Rivetti, E. Chiancone, The neutrophil-activating Dps protein of Helicobacter pylori, HP-NAP, adopts a mechanism different from Escherichia coli Dps to bind and condense DNA, Nucleic Acids Res. 35 (2007) 2247–2256. https://doi.org/10.1093/nar/gkm077.

[7] R. Kamyshinsky, Y. Chesnokov, L. Dadinova, A. Mozhaev, I. Orlov, M. Petoukhov, A. Orekhov, E. Shtykova, A. Vasiliev, Polymorphic Protective Dps–DNA Co-Crystals by Cryo Electron Tomography and Small Angle X-Ray Scattering, Biomolecules. 10 (2020) 39. https://doi.org/10.3390/biom10010039.

[8] L.A. Dadinova, Y.M. Chesnokov, R.A. Kamyshinsky, I.A. Orlov, M.V. Petoukhov,

A.A. Mozhaev, E.Y. Soshinskaya, V.N. Lazarev, V.A. Manuvera, A.S. Orekhov, A.L. Vasiliev, E.V. Shtykova, Protective Dps–DNA co-crystallization in stressed cells: an in vitro structural study by small-angle X-ray scattering and cryo-electron tomography, FEBS Letters. 593 (2019) 1360–1371. https://doi.org/10.1002/1873-3468.13439. [9] E.V. Dubrovin, L.A. Dadinova, M.V. Petoukhov, E.Yu. Soshinskaya, A.A. Mozhaev, D.V. Klinov, T.E. Sch?ffer, E.V. Shtykova, O.V. Batishchev, Spatial organization of Dps and DNA–Dps complexes, Journal of Molecular Biology. 433 (2021) 166930.https://doi.org/10.1016/j.jmb.2021.166930.

Ведущий научный сотрудник кафедры физики полимеров и кристаллов Е.В. Дубровин