Сканирующие зондовые микроскопы: атомно-силовой и капиллярный
В лабораторном корпусе А на втором этаже можно найти четыре комнаты, заполненные микроскопами — это лаборатория профессора кафедры физики полимеров и кристаллов Игоря Владимировича Яминского. Здесь можно найти капиллярные и атомно-силовые микроскопы, в том числе один из первых, сделанных в России.
Расскажите про установку. Как она называется?
Рассказывает профессор кафедры физики полимеров и кристаллов Яминский Игорь Владимирович.
Официальное название: атомно-силовой микроскоп, а точнее — сканирующий зондовый микроскоп. Это название объединяет в себе различные виды микроскопии: атомно-силовую (АСМ), туннельную, магнитно-силовую, электросиловую, резистивную, пьезоэлектрическую, ближнего поля и многие другие виды. В объёме нанометров эти методы позволяют изучать практически все физические свойства материалов (механические, топографические, электрические и магнитные свойства).
Также можно изучать и химические свойства — реакции, происходящие локально на поверхности (например, на поверхности образца, при подаче на кончик зонда электрического напряжения). В качестве примера такой реакции можно привести локальное анодное окисление. Мы работаем с локальным анодным окислением графита, титана и кремния. Получается способ записи информации с точностью порядка нанометров. Можно даже сделать рисунки с такой точностью по трем координатам — получается двухмерная и даже трехмерная картинка.
Наш прибор называется многофункциональный сканирующий зондовый микроскоп ФемтоСкан, и между собой мы называем его просто ФемтоСкан. Фемто — это приставка, обозначающая 10 в минус 15 степени. Хороший, правильный микроскоп — это тот, который позволяет изучать расстояния в 10^(-15) метра, токи в 10^(-15) ампер, и прикладывать силу к изучаемому образцу порядка 10^(-15) ньютонов. А если делать на базе сканирующего микроскопа ёмкостной, то точность должна быть 10^(-15) фарад.
То есть правильно построенный микроскоп должен обладать вот такой чувствительностью, 10^(-15). Иногда такой микроскоп называют наномикроскопом — это тождественно фемтоскану, потому что микро - это 10^(-6), нано — 10^(-9), а вместе получается 10^(-15).
Из чего состоит установка?
Как и у большинства приборов: механика, электроника и программное обеспечение. Всё, кроме используемого компьютера, делаем сами, это наша собственная разработка, российская. Механику начинали делать в механических мастерских физфака. Схемотехника электроники тоже полностью оригинальная.
Если говорить про микромеханику, то есть две ключевые вещи. Первая — это кантилевер, балка, закреплённая с одной стороны. Можно привести аналогию в виде разводных мостов в Санкт-Петербурге, которые тоже закреплены с одной стороны — кантилеверные мосты. У самолета крыло — тоже кантилевер. В фигурном катании тоже есть элемент, когда фигуристка выгибается назад, и получается некое подобие катилевера.
В нашем случае кантилевер — упругая балка длиной примерно 100-250 микрон, шириной 35 микрон и толщиной порядка единиц микронов. На свободном конце балки располагается острая иголка, зонд. Желательно делать так, чтобы на окончании иголки был один атом, то есть чтобы поверхность сканировалась с помощью одного единственного атома.
Вторая важная вещь — это модуль перемещения образца. Мы больше любим сканировать образцом при неподвижном кантилевере, хотя можно и наоборот. Это позволяет добиться более высокой точности, так как оптическая система микроскопа в таком случае неподвижна. Для перемещения образца мы используем пьезокерамический манипулятор. В простом случае это может быть специальная трубка, которая перемещает образец по 3 координатам, или, например, можно использовать планарный пьезосканер. У очень точных сканеров перемещения могут быть в диапазоне от 1 мкм и до 10-150 мкм в плоскости и 1-40 мкм по высоте — в этом диапазоне размеров мы можем сканировать поверхность образца.
Мы часто говорим про аналогию между граммофонным проигрывателем и атомно-силовым микроскопом. У них много общего: есть игла, которая скользит по поверхности и отслеживает рельеф, а дальше с помощью преобразователя можно запустить проигрывание звука. Мы тоже можем послушать, как звучат разные поверхности — с хорошим музыкальным слухом удаётся даже отличить просто шероховатую поверхность от кристаллической решетки, например. С помощью этого можно получать дополнительную информацию об объекте и о качестве сканирования.
Какое программное обеспечение вы используете?
Мы сами написали все программы, которые используем на компьютере, но у самого микроскопа есть еще внутренний компьютер. Здесь может быть два варианта.
Сначала мы делали микроскопы на цифровом сигнальном процессоре компании Analog Devices — это примерно такой же микропроцессор, какие устанавливаются в мобильные телефоны. Управлять микроскопом непосредственно с компьютера плохо, потому что компьютер дает временные задержки, а нам надо в реальном времени получать сигнал. Это позволяет сделать сигнальный процессор — на нём была «построена» вторая модель нашего микроскопа ФемтоСкан.
Сейчас мы перешли на программирование логических интегральных схем (ПЛИС) — набор отдельных логических блоков, которые мы аппаратно программируем, чтобы быстро снимать и обрабатывать информацию, формировать управляющие сигналы. Сейчас мы работаем на кристалле с тактовой частотой 100 МГц, обработка сигналов идет на 1 МГц. Получается такая быстрая электроника, которая позволяет получать кадры большого размера — это может быть 1000 на 1000 или 2000 на 2000 точек, изображение получается детальное. Когда игла быстро едет по поверхности, мы можем отслеживать мельчайшие элементы, вплоть до положения каждого атома.
ПЛИСы дают необычайную гибкость в создании правильных алгоритмов. У меня на физическом факультете защитил бакалаврскую работу Корнилов Дмитрий Владимирович — его работа называлась «Программные алгоритмы высокоскоростного сканирующего зондового микроскопа». Он реализовал программным образом новый режим сканирования, когда иголка отводится от образца, и потом падает вниз на постоянной или переменной скорости. Таким методом очень точно определяется момент касания, причем это может быть или непосредственно момент касания, или более сильное касание (выбираем сами, чтобы не было сильного разрушающего воздействия, как правило). После этого иголка отодвигается обратно, сдвигается по координате XY. Получается такое сканирование, как будто идем по образцу иглой швейной машинки. Таким образом, можно сканировать мягкие поверхности, видеть детали и отростки на поверхности бактерий, и даже двойную спираль ДНК. В этом методе падает скорость сканирования, но растет разрешение. Назвали мы его «флирт-мода», потому что происходит такое лёгкое, деликатное, нежное касание, но оно не портит образец.
Обратная связь в микроскопе реализована или через сигнальный процессор, или через ПЛИСы. Мы должны очень точно определять положение кантилевера, с точностью примерно в 100 раз меньше, чем размер самого маленького атома водорода. Это реализуется с помощью оптической схемы: на поверхность кантилевера направляется лазерный луч, который отражается на фотодетектор. Обычно у нас работает трансформатор перемещений — перемещение кантилевера составляет нанометры, а пятна на фотодиоде — микрометры, в 1000 раз больше. Такой трансформатор перемещений чувствительный и удобный в настройке.
Итоговая схема получается такая: направляем лазерный пучок на кончик кантилевера, ловим отраженный свет, за счет обратной связи двигаем образец так, чтобы кантилевер был в одном и том же положении. Так получаем чувствительность по координате Z в тысячные доли нанометров.
Вместе с тем, мы внимательно смотрим, что есть на рынке, выбираем лучшую элементную базу — экономить на этом нельзя. Но, с другой стороны, электронику мы строим сами, как Lego, можем построить все, как нам хочется. Мы всегда работали в условиях ограниченного бюджета, поэтому он тоже играет определенную роль. По быстродействию у нас получается лучше, чем у лучших плат LabView и, кроме того, неизвестно, что будет с этими платами LabView через 5-10 лет.
Какие физические принципы в основе самого способа микроскопии? Какое взаимодействие изучает АСМ?
Я бы сказал, что это очень нетривиальный вопрос. Есть стандартная модель: гравитационное, электромагнитное, сильное, слабое взаимодействия. Когда зонд давит на поверхность, получается реакция опоры. А какое это взаимодействие? Сила взаимодействия между телами — к какому взаимодействию относится? Ни к какому, это есть не взаимодействие, это запрет Паули. Мы не проваливаемся сквозь пол, потому что есть запрет Паули.
С одной стороны, это не является взаимодействием как таковым, но с другой стороны — есть сила, энергия, то есть величины, присущие взаимодействию. Сам Фейнман говорил, что запрет Паули есть самая загадочная вещь квантовой механики. Это обеспечивает стабильность всего нашего мира, если вдруг запрет пропадет, то всё начнет рушиться.
Сила упругости имеет характер обменного взаимодействия. То есть измеряется сила взаимодействия между атомами на кончике иглы и атомами, которые находятся под ним. Вот там есть коллективное взаимодействие, потому что это взаимодействие мы можем рассчитывать, например, потенциалом Леннарда-Джонса. На маленьких расстояниях — сила притяжения (Ван-дер-Ваальса), с чисто электромагнитной природой. А сила отталкивания идёт из-за принципа запрета Паули. Упругие свойства можем изучать, можем перемещать молекулы, атомы в рисунки — как хотим.
Чем установка уникальна? Понятно, что она уже уникальна тем, что вы её сами собрали. А чем ещё?
Если микроскоп такого типа собран правильно, то он будет работать на фундаментальном физическом пределе. То есть разрешение микроскопа ограничивают тепловые колебания кантилевера и образца. Разрешение по XYZ ограничивает еще точность поддержания силы. Поэтому правильно собранные микроскопы показывают примерно одинаковые картинки атомной структуры образцов.
Есть только много нюансов у разных приборов: насколько удобно и легко ставить образец, насколько понятно ПО, сколько сил надо потратить, чтобы освоить этот прибор, насколько он надежен (ломается или нет). Сначала надо поставить кантилевер, образец, настроить систему, запустить сканирование. Дальше работа чисто с компьютером. Должна быть хорошая графика. Наше ПО становится мировым стандартом. Eго используют практически во всех индустриальных странах. Например, в медицинском центре Небраска около 45 лицензий, хотя у них есть практически все микроскопы, которые произведены в разных странах. Написал ПО студент физфака (сейчас уже не студент, а сотрудник) Филонов Александр и научный сотрудник Савинов Сергей Валентинович. Сейчас над развитием программного обеспечения работают два студента физического факультета и одна недавняя выпускница физфака.
Какие основные направления исследования?
Когда-то давно взяли основным направлением биологическое. С одной стороны, это наиболее сложно организованная часть материи, с другой стороны — часто хорошо структурированные объекты.
Среди больших направлений была работа с кафедрой вирусологии, академиком Атабековым Иосифом Григорьевичем — мы смотрели вирусные частицы. Нас интересует не только внешний вид вирусов, но и их механическая устойчивость — это новое направление в биологии, которое интересуется, что является главным в устойчивости? Например, есть вирус табачной мозаики (палочка 18 нм в диаметре, 300 нм в длину). Чтобы она инфицировала растение, она должна освободить РНК из своей белковой оболочки. Мы активно изучали этот механизм и выявили роль концевых белков в этом процессе.
Второе направление — бактериальные клетки, их морфология, поверхность, превращения (из обычной формы в споры) механическая жесткость бактерий, их адгезия к разным поверхностям. Сейчас активно работаем над тем, чтобы определять резистентность бактерий к антибиотикам. На базе зондовой микроскопии строим приборы для очень быстрого обнаружения вирусов и патогенных бактерий.
В последнее время активно работаем над изучением клеток растений, опухолевых клеток, визуализацией клеток и измерением механической жесткости практически в естественных условиях. Другого способа для таких исследований, кроме АСМ, сейчас нет.
В настоящее время мы активно работаем в рамках междисциплинарного научного проекта МГУ с кафедрой вирусологии биологического факультета, научной группой профессоров Карповой О.В. и Никитина Н.А. под названием "3D визуализации вирионов, структурно модифицированных и вирусоподобных частиц вирусов растений методами бионаноскопии" (23-Ш04-04). В пятом номере журнала «Наноиндустрия» выходит наша совместная публикация о наблюдении вируса табачной мозаики «3D визуализация и характеризация вирусов растений методами бионаноскопии». Это начало большого проекта.
Детали структуры поверхности вирусных частиц и вариации их локальных свойств (упругости, стабильности, геометрических параметров нанорельефа, гидрофобности/гидрофильности и пр.) будут впервые определены с нанометровым пространственным и миллисекундным временным разрешением в динамике в процессе их жизненного цикла. Существенно, что прилагаемые методы – зондовая и микролинзовая микроскопия – позволяют проводить визуализацию объектов живой природы без использования дополнительных реагентов, красителей и меток. Информация, полученная в ходе выполнения проекта, позволит успешно применять вирусоподобные частицы в фармакологии. Полученные данные также дадут дополнительный материал для каталогизации вирусов растений, имеющихся в коллекции кафедры вирусологии биологического факультета МГУ.
Благодаря выполнению проекта будут получены новые данные о вирусах растений и свойствах вирусоподобных частиц, которые могут быть использованы для дальнейшего развития их в качестве инструментов новых биомедицинских технологий.
Что еще можно исследовать с помощью такого микроскопа?
Можно использовать микроскоп как сканирующий туннельный микроскоп. Проводящая игла подносится к поверхности, между ними возникает туннельный ток на расстоянии около 1 нм, который затем поддерживается с помощью обратной связи.
Сначала ученые сделали сканирующий туннельный микроскоп, потом ближнепольный, и в 1986 году атомно-силовой, чтобы измерить силы в туннельном микроскопе. Туннельный микроскоп работает в основном в вакууме.
С помощью такого микроскопа нельзя посмотреть на алюминий, потому что на его поверхности есть тонкая непроводящая оксидная плёнка. Вода тоже может мешать в туннельном микроскопе. Но можно смотреть, например, золото, графит.
Режимы работы микроскопа универсальны, можно использовать на разных приборах, но преимущества видны на биологических объектах.
Какие уникальные характеристики есть у установки?
Мы сделали полное управление через Интернет. Рост бактерий, белковых кристаллов (лизоцим), все, что в эволюции и требует длительного наблюдения — позволяет осуществлять наша реализация.
С другой стороны, это удобно для обучения студентов, я могу следить за несколькими приборами, посоветовать исправить что-то в режиме сканирования и так далее. Еще можно дистанционно подать, например, потоки воздуха, работать с жидкостными ячейками.
Если говорить о предельных характеристиках, то они должны быть одинаковыми (определяются фундаментальными вещами).
Наше ПО более удобное, в том числе, для обработки. У нас есть микроскопы в ЦКП физфака, там проходят занятия для школьников (получают изображения атомов на поверхности графита, питов на DVD дисках, бактериальных клеток, молекул блоксополимеров и т.д.).
Есть ли аналоги?
В 1985 году на физическом факультете был сделан первый туннельный микроскоп (в России). В 1987 году мы сделали более-менее серийный туннельный микроскоп Скан-8.
С 1985-1990 было много компаний, которые делали туннельные микроскопы, после перестройки остались практически только две: мы и NT-MDT. С 1987 по 1990 год мы всем рассказывали как делать микроскопы. Но в результате микроскопы получились у NT-MDT, около 15% Россия держала на мировом рынке. Еще в мире есть Bruker (основной игрок), Omicron, Park Systems. В 1987 году возникла Digital Instruments. За 10 лет они стали одной из сильных компаний, двигались одновременно с нами. У нас есть зарубежные поставки, в Италию и Иран, например.
Есть ли особенные условия для работы вашего прибора?
Для больших микроскопов с плохой жесткостью нужно шумоподавление. А мы сделали жесткую механику, достаточно подставки из поролона, шумов нет. Небольшая наводка может идти, если говорить громко. Но если не шуметь, то всё в порядке.
Какие есть лайфхаки и особенности работы на установке?
Российская копеечка используется для установки образца за счет примагничивания к микроманипулятору. Это можно сделать быстро, но можно сделать вообще без магнита вариант.
Кантилеверы мы покупаем (делают их в Зеленограде, или покупаем у Bruker). Сначала сканируем на большой области, потом рассматриваем маленький участок более подробно. Если образец грязный, кантилевер может испортиться за счет налипания этой грязи.
За последнее время мы сделали самую быструю в мире электронику и ПО, но нас пока задерживает по скорости механика. Для более быстрого сканирования кантилевер должен быть очень маленьким, а в таком случае сложнее сфокусировать свет на нём. С другой стороны, у нашей «флирт-моды» (у разных компанийr это Peak Force, Tapping mode, Jumping mode, Hopping mode) с обратной связью скорость в 3 раза быстрее Peak Force у Bruker, а силовое воздействие при сканировании одинаковое. Основные подложки, чтобы смотреть образцы — графит и слюда. Решетку на слюде и атомы на графите наш прибор может различить, так как шумов нет. Наблюдать атомы в наш микроскоп стало можно еще в 1987 году.
Кто работает на приборе?
Студенты, аспиранты. Есть много приборов, которые отличаются по скорости сканирования, для больших и малых полей.
Есть два быстрых микроскопа в ЦКП физфака. Здесь, например, микроскоп для работы с биологическими образцами в жидкости. Он совмещен с инвертированным микроскопом.
У нас тренировка — это рассматривать металлический выступы («пеньки), которые предоставил нам Борис Альбертович Логинов, сотрудник МИЭТ. Надо сначала учиться наблюдать простые объекты, а потом переходить к биологическим. С такими объектами при неопытности возникают проблемы при пробоподготовке.
Возможно ли провести на этой установке эксперимент человеку из другой научной группы?
Да, если видно, что человек понимает основы работы, то мы его обучаем и обычно через день можно уже работать. Можно приходить со своими образцами, получать данные, публиковать статьи. Кроме лабораторий МГУ, сотрудничаем с институтом Гамалеи, центром Чумакова — по вирусам и вакцинам (вирус гриппа), Институтом вирусологии, Imperial college (капиллярный микроскоп) и многими другими российскими и международными центрами.
Капиллярный микроскоп
Рассказывает Тимофей Советников (магистрант второго года обучения кафедры полимеров и кристаллов).
Капиллярный микроскоп еще называют ион-проводящим. Он является разновидностью сканирующего зондового микроскопа и используется в первую очередь для изучения живых биологических систем. Такое применение объясняется рядом его ключевых преимуществ перед другими методами зондовой микроскопии: возможностью исследования объектов без силового воздействия в естественной среде – солёной воде – и без сложной пробоподготовки.
В ходе сканирования мы как бы «водим» по поверхности образца тончайшим капилляром, в ходе чего происходит измерение величины тока, которая используется для получения сигнала обратной связи. Сканирование должно происходить в проводящей, электролитической среде — например, в физрастворе. Такие условия обычно являются естественными для биологических образцов.
Как выглядит процесс сканирования?
В качестве зонда в капиллярном микроскопе используется, что не удивительно, стеклянный капилляр, диаметр отверстия в котором имеет нанометровый масштаб и обычно составляет от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров. Исследуемый объект располагается в чашке Петри под капилляром. Капилляр и среда с образцом заполняются электролитом, внутрь капилляра помещают хлор-серебряный электрод (серебряную проволоку, покрытую хлоридом серебра), второй электрод помещается в чашку Петри с исследуемым образцом. При создании разницы потенциалов между электродами протекает ионный ток (отсюда возникает второе название микроскопа, ион-проводящий) величиной в единицы наноампер. Когда кончик капилляра приближается к поверхности образца ток падает на доли процента. Благодаря возможностям высокоточного усилителя тока этот сигнал можно зарегистрировать, аккуратно позиционируя капилляр над поверхностью и получая информацию о высоте образца в данной точке.
Повторяя процесс подвода-отвода к разным точкам образца, на подобие работы «флирт моды» в атомно-силовом микроскопе, мы получаем полную карту его поверхности.
Разрешение капиллярного микроскопа определяется диаметром конца иглы (может быть порядка десятков нанометров), иглы мы делаем сами из специальных заготовок. В сравнении с АСМ в капиллярном микроскопе нет взаимодействия с образцом, потому что игла его не касается. Но и разрешение у капиллярного микроскопа меньше, чем у АСМ. Можно варьировать диаметр капилляра, подбирать разные скорости сканирования и величины разрешения.
Как устроена экспериментальная установка?
Установка капиллярного собирается на базе инвертированного оптического микроскопа, что даёт возможность наблюдать исследуемый образец и в оптике и позволяет удобно позиционировать зонд при выборе области сканирования. Благодаря этому можно также совместить измерения на капиллярном микроскопе с оптическими методами исследований (флуоресцентной, конфокальной и др. методами микроскопии) часто применяющимися в биологии.
Схема самого микроскопа имеет много общего с АСМ, в ней задействованы: высоковольтный усилитель, подающий сигнал на перемещающие образец пьезокерамические подвижки; высокочувствительный усилитель ионного тока, создающий разницу потенциалов между электродами и измеряющий величину текущего ионного тока (в этом случае он заменяет оптическую систему регистрации положения АСМ-зонда – кантилевера) и блок управления, «электронные мозги» микроскопа, управляющие процессом измерений и передающий результаты на компьютер.
Сегодня мы создаем такой микроскоп собственными руками – разрабатываем электронику и высокочувствительную систему регистрации тока, собираем механику и, наконец, объединяем все компоненты на базе собственного ПО.
Что можно исследовать на капиллярном микроскопе?
Капиллярный микроскоп может использоваться для анализа целого ряда параметров поверхности образца и проходящих вблизи неё процессов. Можно получать данные не только о топографии, но и о механических свойствах живой материи, измерять распределение заряда на поверхности клетки, регистрировать испускаемые ею химические маркеры.
Благодаря возможности изучения живых систем в естественной среде можно напрямую исследовать их жизненный цикл, например отслеживать движение клетки и считывание ею внешних условий среды. Большой интерес представляют методы направленной доставки веществ к исследуемому образцу и нанесения на него/подложку наноразмерных двух- и трёхмерных структур. Подобные методики позволяют изучать реакцию биосистем на внешнее воздействие, превращая зонд микроскопа в новый вариант биосенсора.
Примерами таких приложений могут быть изучение отклика клеточной системы на терапевтическое воздействие; нанесение на поверхность клетки рецепторного слоя нужного вида; доставка антител, белков, вирусов, ДНК на поверхность или внутрь клетки и многие другие.
Как можно присоединиться к нашей работе?
Наша лаборатория всегда рада студентам, желающим поучаствовать в исследованиях и разработках! Договориться о встрече или обратиться с вопросом можно к Тимофею Советникову, магистранту нашей группы.
- email: science@nanotomed.ru
- telegram: @timsovetnikov
Подробнее о нас
Можно узнать на нашем сайте: http://nanotomed.ru/
В скором времени мы расскажем о научной группе физики живых систем подробнее!
Команда Медиацентра факультета